ACTH-Bestimmung
beim Hund -
Validierung eines Chemolumineszenz-Immunometrischen Assays und präanalytische
Stabilisationa
von Dr. C. Schwedes1 und Dr. W. Müller2
1Tierärztliche Klinik Dr. Unger, Klinkerberg 3, 86152 Augsburg
2Labor Alomed, Öschlestr. 77, 78315 Radolfzell-Böhringen
Problemstellung
Erkrankungen , die mit hormonellen Störungen einhergehen, kommen insbesondere
bei älteren Hunden häufig vor. Eine dieser Erkrankungen ist der Hyperadrenocortizismus,
der durch eine Überproduktion von Cortisol durch die Nebennierenrinde
gekennzeichnet ist. Hierfür kommen zwei Ursachen in Frage: einerseits
die zu starke Anregung der Nebennierenrinde zur Cortisolausschüttung,
bedingt durch eine zu starke Ausschüttung des Adrenocorticotropen Hormons
(ACTH) im Hypophysenvorderlappen (HVL), andererseits eine autonome Überproduktion
von Cortisol ohne äußere regulatorische Einflüsse. Eine zweite Erkrankung
ist der Hypoadrenocortizismus (Morbus Addison), der durch eine Unterfunktion
der Nebennierenrinde gekennzeichnet ist. Die Messung der ACTH-Konzentrationen
im Blut kann Hinweise zur genaueren Charakterisierung der Erkrankung
geben.
Klinisch bedeutsam ist die Bestimmung des ACTH-Spiegels in den Fällen,
in denen ein M. Cushing oder ein M. Addison bereits diagnostiziert wurde
und eine Differenzierung der Verlaufsform für die Erstellung des Therapieplans
und die prognostische Einschätzung notwendig ist. Mit einer ACTH-Bestimmung
lässt sich in vielen Fällen der high-dose Dexamethason Test, der eine
zweimalige Blutentnahme im Abstand von 8 Stunden vorschreibt umgehen.
Weiterhin kann die therapiebegleitende Kontrolle des ACTH-Spiegels wertvolle
Hinweise zur Effizienz der Therapie geben.
Die ACTH-Bestimmung ist bisher in bezug auf die Probennahme und Versand
sehr aufwendig: ACTH ist ein Peptidhormon, das von Proteasen in vitro
schnell abgebaut wird. Die Empfehlung lautet daher, das Blut in eisgekühlte
EDTA-Röhrchen abzunehmen, in der Kühlzentrifuge zu zentrifugieren und
tiefgefroren auf Trockeneis zu versenden.
Erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass eine Hemmung des Abbaus
von ACTH mit Hilfe von Aprotinin (TrasylolÒ) möglich ist und so die
Lagerungsfähigkeit der Proben soweit gesteigert werden konnte, dass
auf ein Einfrieren verzichtet werden konnte. Dieses Verfahren wurde
für einen Radioimmunoassay (RIA) entwickelt.
Die bisher übliche Methodik der ACTH-Bestimmung beruhte auf der Technik
des RIA. Kürzlich wurde ein neuer, hochsensitiver immunoradiometrischer
Assay entwickelt, der auch erfolgreich zur Bestimmung von ACTH beim
Hund eingesetzt wurde. Dieser Assay wurde von der Herstellerfirma modifiziert:
durch Kopplung der Antikörper mit Chemolumineszenzmarkern kann auf radioaktives
Material verzichtet werden. Ziel unserer mit Hilfe der Gesellschaft
zur Förderung kynologischer Forschung durchgeführten Arbeit war es,
-
Eine von radioaktiver Belastung freie Methode der
ACTH-Bestimmung mittels Chemolumineszenz für den Hund zu erproben
und Referenzbereiche zu erstellen
-
Die Erprobung einer Stabilisation des ACTH, so dass
die Proben auf dem normalen Postweg verschickt werden können.
Dazu wurde zunächst die Analysemethode für die Tierart Hund validiert.
Dann wurden bei gesunden Hunden Blutproben entnommen und einmal auf
herkömmliche Weise behandelt, d.h. sofort tiefgefroren und auf Trockeneis
verschickt, zum anderen mit einem Stabilisator versetzt und auf dem
normalen Postweg ins Labor geschickt. Die Ergebnisse wurde verglichen
und die zu erwartenden ACTH-Konzentrationen bei gesunden Hunden ermittelt.
Ergebnisse
Die Hemmung des ACTH-Abbaus mittels des von uns entwickelten Stabilisators
ist möglich. Die Ergebnisse des Laborversuchs zeigt Abb. 1.:
Beim Vergleich von 30 Proben mit und ohne Stabilisator war der in den
Stabilisator-Cocktail-Proben ermittelte Wert im Schnitt 93,4 ± 15,3
% im Vergleich zu den reinen EDTA-Proben. Bei der Berechnung wurden
Werte direkt an der Nachweisgrenze ausgeschlossen, da sie die prozentuale
Berechnung verfälschen würden.
Der von uns ermittelte Median von ACTH-Konzentrationen bei gesunden
Hunden lag bei 31,5 bzw 33 pg/ml in den EDTA bzw den Stabilisatorproben.
Die 25 Prozent-Grenze lag bei 19, die 75% Grenze bei 48 pg/ml bei einer
Spannweite von 4-230 pg/ml für die sofort tiefgefrorenen Proben und
2-195 pg/ml für das Stabilisator-Plasma (Abb. 2).
Diese hohe Spannweite ist dadurch erklärbar, dass die Ausschüttung des
Hormons ACTH immer stossweise erfolgt und es im Blut rasch abgebaut
wird.
Schlussfolgerungen
Der von uns erprobte Chemolumineszenzassay zur ACTH-Bestimmung beim
Hund in Kombination mit dem von uns entwickelten Stabilisationsverfahren
ist möglich und unter den Bedingungen der tierärztlichen Praxis durchführbar.
Es sind dafür jedoch spezielle Blutentnahmeröhrchen erforderlich.
Ausblick
Das Verfahren ist vielversprechend und soll in der weiteren Forschungsarbeit
an klinischen Patienten mit Hyper- und Hypoadrenocortizismus überprüft
werden. Insbesondere ist zu klären, inwieweit die ACTH-Bestimmung in
dieser Form zur Differenzierung und ggf. Therapieüberwachung der verschiedenen
Formen des Hyper- und Hypoadrenocortizismus geeignet ist.
a Vorgestellt auf der 8. Jahrestagung der Fachgruppe Innere
Medizin und Klinische Labordiagnostik der DVG, 4. - 6.3.1999 in München
Weitere Literatur:
Schwedes C, Müller W, Bestimmung des endogenen ACTH beim Hund,
Tierärztl Prax 2000; 28 (K): 65-70 |
